方法开发的总体目标是在尽可能短的时间内优化目标物的分离度，首先我们先了解一下分离度的计算公式：分离度代表色谱柱分离目标峰的能力，因此分离度越高，两峰之间越容易得到基线分离，从图一的分离度方程可以看出分离度与柱效、选择性和保留值相关。可以通过改善这些因素来提高分离度。
从图二中可以看到影响分离度的因素在分离过程中均有不同的作用，然而选择性对分离度的影响最大也是最直接的。我们可以通过改变色谱柱的键合相或者改变流动相这两种方式对分离度产生影响。反相色谱是目前为止最通用的HPLC的分析方法，大约占所有方法的60% ，将近95%的色谱工作者都在使用。所以分离模式上面我们首要选择反相色谱模式，其次色谱柱和填料方面我们可以选择最常用的C18色谱柱，根据目标分析物的分子量选择相应的填料孔径。一般分子量在2000以下的小分子采用的填料孔径在80-120Å。虽然同样都叫C18色谱柱，但由于各个厂家的生产工艺不同，我们还需要考虑色谱柱的含碳量、比表面积、键合密度以及是否封尾等因素。如仍然不能达到分离效果可以选择不同固定相的色谱柱填料，比如C8、C4、苯基柱、氰基柱、五氟苯基柱等。流动相中有机溶剂一般采用乙腈或甲醇，同时我们建议一定要使用色谱级以上的溶剂和改性剂。在反向色谱中，流动相中水相的pH和离子强度在开发对条件微小变化不敏感的耐用方法中非常重要。对于离子型化合物，典型样品的保留随pH改变而明显变化。在这类反相系统中，控制pH对于保留和选择性的稳定非常重要。通常在pH2到4条件下，保留时间对pH的微小改变稳定性最高。因此建议将这一pH范围作为大多数样品方法开发的起始pH。分析形式存在，反相条件下更高保留，保留时间稳定，无次级作用力；
分析形式和离子形式共存，峰容易分叉或者拖尾，较强的次级作用力，保留不稳定；
分析形式和离子形式共存，峰容易分叉或者拖尾，较强的次级作用力，保留不稳定；
从上图中可以看出流动相的pH对色谱分离的影响有多种方式。根据您所分析的化合物pH可能影响选择性、峰形和保留。如果是中性化合物，pH对分离度和保留的影响一般是不明显的。在确定了色谱柱规格、合适的固定相柱填料、流动相溶剂和改性剂后，即可开始优化方法。方法的优化是根据最终目标决定的。如果目标是得到高分离度，节省分析时间并不是首要问题，可以选择长柱是所有组分都得到最大分离度。如果分离速度很重要，则应使用短柱和高流速。对于含许多目标化合物的复杂样品，需要优化梯度方法等。
